Expresión y serorreactividad de la lipoproteína recombinante de 43-kDa de Bartonella bacilliformis / Expresión and seroreactivity of the recombinant Bartonella bacilliformis 43-kDa lipoprotein

Objetivo: La lipoproteína de 43-kDa de Bartonella bacilliformis fue obtenida en su forma recombinante (rBbLppB) ypurificada para evaluar su serorreactividad mediante ELISA. Materiales y métodos: Los niveles de anticuerpos IgG eIgM humanos en los sueros de pacientes con Bartonelosis confirmada y sueros de otras enfermedades (salmonelosis,Brucelosis y leptospirosis) frente a rBbLppB fueron evaluados por ELISA, se utilizó sueros de personas sanas comocontroles. Resultados: La sensibilidad y la especificidad del ELISA IgG fueron 70,4 y 90 respectivamente. Asimismo,la sensibilidad y especificidad de ELISA IgM fueron 85,2 y 90 respectivamente. Conclusiones: Estos resultadosdemuestran que el ELISA usando rBbLppB tiene una buena sensibilidad y especificidad y puede ser consideradacomo un buen antígeno para el diagnóstico de Bartonelosis causada por B. bacilliformis.

Objective: The Bartonella bacilliformis 43-kDa lipoprotein was obtained from its recombinant form (rBbLppB) and then, purified to evaluate sero-reactivity through ELISA. Material and methods: IgG and IgM humanantibodies levels in the sera of patients with confirmed Bartonellosis and sera of patients with other diseases (salmonellosis, Brucellosis and Leptospirosis), when contrasted with rBbLppB were evaluated by ELISA. Sera from some healthy people were used for controls. Results: Sensitivity and specificity of the IgG ELISA were 70,4% and 90% respectively. Also, sensitivity and specificity of the IgM ELISA were 85,2% and 90%, respectively. Conclusions: These results show that ELISA using rBbLppB is highly sensitive and specific and may be considered a good antigen for the diagnosis of Bartonellosis caused by B. bacilliformis.

Clonamiento, expresión y seroreactividad del antígeno recombinante flagelina de Bartonella bacilliformis / Cloning, expression and seroreactivity of recombinant antigen flagellin of Bartonella bacilliformis

Objetivos. Clonar el gen de la flagelina A (flaA) de Bartonella bacilliformis, expresar y evaluar preliminarmente la seroreactividad de la proteína recombinante a sueros de pacientes con Bartonelosis por B. bacilliformis. Materiales y Métodos. Se diseñó una pareja de oligonucleótidos iniciadores ûBbFlaA1 y BbFlaA2û para la amplificación del gen completo de la flagelina flaA de B. bacilliformis. El producto de amplificación obtenido se clonó en pGEM y luegose subclonó en el vector de expresión pGEX4T-1. Se indujo la expresión de la proteína de fusión rBbFlaA-GST con isopropil tio-β-D-galactosido (IPTG). La proteína de fusión producida fue digerida con trombina para liberarla de GST. Finalmente, una prueba de ELISA fue estandarizada para detectar los anticuerpos IgG contra la proteína de fusión rBbFlaA-GST y rBbflaA libre de GST. Se evaluaron sueros de pacientes con diagnóstico de Bartonelosis por B. bacilliformis (n= 30), sueros de individuos sanos (n= 20) y sueros de pacientes con otras enfermedades de posible reactividad cruzada; entre ellas, Brucelosis (n= 3), leptospirosis (n= 3) y salmonelosis (n=7). Resultados. Se determinó quepara la expresión óptima en E. coli BL21 de la proteína de fusión rBbFlaA se requiere que el cultivo crezca en caldo LB/ampicilina a 30 °C suplementado con 2 por ciento de glucosa a partir de un preinóculo de 100 μL (crecido por toda la noche), hasta que alcance una densidad óptica de 1 OD600 y se induzca por dos horas con 2,5 mM de IPTG. Finalmente, el 57,6 por ciento (17 de 30) sueros de pacientes con diagnóstico confirmado de bartonelosis reaccionaron con la proteínarecombinante BbFlaA en el formato de ELISA. Conclusiones. Se logró expresar exitosamente en E. coli la proteína recombinante BbFlaA de B. bacilliformis, determinándose un protocolo de expresión y de purificación de rBbFlaA para la producción de esta proteína. Así también, el antígeno rBbFlaA es reconocido por anticuerpos de sueros de pacientes con Bartonelo...

Objectives: To clone the Bartonella bacilliformis flagellin gene (flaA), and to preliminarily express and assess reactivity of the recombinant protein against B. bacilliformis bartonellosis patients' sera. Materials and Methods: A couple of initiating oligonucleotides was designed -BbFlaA1 and BbFlaA2- for complete B. bacilliformis flagelline A gene amplification. The amplification product obtained was cloned in pEGM, and later it was subcloned in pGEX4T-1 expression vector. Fusion protein rBbFlaA-GST expression was induced with isopropyl thio-β -D-galactoside (IPTG). The fusion protein produced was digested with thrombin in order to release its GST contents. Finally, an ELISA test was standardized in order to detect IgG antibodies against fusion protein rBbFlaA-GST and rBbflaA GST-free. Sera from patients with bartonellosis caused by B. bacilliformis (n= 30), sera from healthy individuals (n= 20), and sera from patients with a possible cross-reactivity; i.e., brucellosis (n= 3), leptospirosis (n= 3), and salmonellosis (n= 7) were assessed. Results: It was determined that for optimal expression of fusion protein rBbFlaA in E. coli BL21, it is required that the culture grows in LB/ampicillin broth at a 30º C temperature, supplemented with 2% glucose from a 100 µL pre-inoculum (left to grow overnight), until it reaches a 1 optical density (OD 600), and being induced for two hours at 2,5 mM IPTG. Finally, 57,6% (17 of 30) sera from patients with a confirmed bartonellosis diagnosis reacted with BbFlaA recombinant protein in an ELISA format. Conclusions: B. bacilliformis BbFlaA recombinant protein was successfully expressed in E. coli, and an rBbFlaA expression and purification protocol was determined for producing this protein. Also, rBbFlaA antigen is recognized by antibodies present in sera from bartonellosis patients infected with B. bacilliformis.

Genotipificación de aislamientos de Bartonella bacilliformis por amplificación de elementos repetitivos mediante el uso de REP-PCR y ERIC-PCR / Bartonella bacilliformis isolates genotypying with repeated elements amplification with REP-PCR and ERIC-PCR

Objetivos: Genotipificar los aislamientos de Bartonella bacilliformis a través de la amplificación de elementos repetitivos mediante el uso de ERIC-PCR y REP-PCR, y determinar si existe variabilidad genética entre aislamientos de varias zonas endémicas. Materiales y Métodos: Se evaluaron mediante el uso del ERIC-PCR y REP-PCR 17 aislamientos de B. bacilliformis de Lima, Cusco y Ancash. Los aislamientos fueron realizados durante los años 1998 y 1999. Para el análisis de los patrones de bandas se usó el software GelCompar 4,0. Resultados: Fueron identificados en los 17 aislamientos 10 genotipos. Los genotipos D, E y H fueron detectados en Cusco; mientras que los genotipos B, C, G, J e I en Lima; y el genotipo F en Ancash. Conclusiones: Nuestros resultados sugieren que REP-PCR y ERIC-PCR son métodos útiles para genotipificar aislamientos de B. bacilliformis. La variabilidad genética debe ser tomada en cuenta en estudios epidemiológicos y clínicos de Bartonelosis; así como el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas y de vacunas

Caracterización e inmunoreactividad de la proteína acídica ribosomal P2ß de L. (V.) braziliensis / Characterization and immunoreactivity of Leishmania braziliensis P2ß acidic ribosomal protein

Introducción: El diagnóstico serológico de la Leishmaniasis usando proteínas totales presenta reacciones cruzadas. la caracterización de nuevos antígenos de Leishmania mejorará el uso de herramientas serológicas en el diagnóstico de esta enfermedad. Objetivo: Caracterizar un nuevo antígeno de Leishmania. Materiales y métodos: Se selecionó el bacteriófago T166-U19 de una biblioteca de cADN de L. (V.) Brasiliensis el cual es reactivo a mezclas de sueros de Leishmaniasis cutánea y mucocutánea. El cADN del clon T166-U19 fue subclonado en el plásmido pGEX, luego secuenciado y la proteína recombinante fue expresada.La reactividad de esta proteína reombnante se evaluó por ELISA. Resultados: El cADN del clon T166-U19 presentó un marco de lectura abierto de 318 pb que traduce una proteína de 105 animoácidos con 81,1 por ciento, 82,9 por ciento y 60,7 por ciento de identidad total con la proteína acídica ribosomal LiP de L. (L.) infantum, P2 de L.(L.) donovani, y P2 de T. cruzi, respectivamente. Además, la proteína recombinante presentó baja reactividad (50 por ciento) con sueros de pacientes con Leishmaniosis, mientras que presentó reactividad cruzada con sueros de pacientes chagásicos. Conclusiones: Se caracterizó por primera vez la proteína acídica ribosomal P2ß de L. (V.) brasiliensis, y presentando baja reactividad con sueros de pacientes con Leishmaniasis

Diseño y estandarización de una prueba de PCR para el diagnóstico de la Bartonelosis causada por Bartonella bacilliformis / Design and standardization of a PCR test for the diagnosis of Bartonellosis produced by Bartonella bacilliformis

Objetivo: Diseñar una prueba de PCR para el diagnóstico de la Bartonelosis causada por Bartonella bacilliformis. Materiales y métodos: Se usó la secuencia de locus de invasión ialB para diseñar los oligonucleótidos ialBR, además del ADN genómico purificado de una cepa referencial de B. bacilliformis para estandarizar las condiciones de la prueba. Finalmente, la prueba fue preliminarmente evaluada con 12 cepas de B. bacilliformis aisladas en 3 áreas endémicas y 10 muestras de sangre total de pacientes con Bartonelosis confirmada. Resultados: La prueba detectó el ADN de aislamientos de B. bacilliformis de 3 áreas bartonelósicas endémicas del Perú: Ancash, Cusco y Lim; mientras que no detectó el ADN de B. hensenlae, ni de B. vinsonii, ni de otras bacterias y parásitos. Además, esta prueba fue positiva para 10 muestras sanguíneas de pacientes con Bartonelosis confirmada y negativa para 5 muestras de pacientes con malaria por P. falciparum. Conclusión: Esta prueba PCR podría ser útil para el diagnóstico de la Bartonelosis causada por B. bacilliformis

Variabilidad genética de plasmodium falciparum en pacientes con malaria grave y malaria no complicada en Iquitos - Perú / Genetic viability of plasmodium falciparum in patients with severe malaria and with non-complicated malaria in Iquitos-Peru

Objetivo: Determinar la diversidad genética del gen que codifica la proteína rica en glutamato (GLURP) de Plasmodium falciparum en pacientes con malaria complicada y no complicada circulante en un área del departamento de Loreto, distrito de Maynas. Materiales y métodos: La diversidad genética fue analizada usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en 30 muestras sanguíneas de pacientes con malaria no complicada (MNC) y 46 con malaria grave complicada (MGC). Resultados: Ocho genotipos fueron detectados en pacientes con MNC (Genotipo I, II, III, IV, V, VI, VII y VIII y cuatro genotipos en los pacientes con MGC (Genotipo V, VI, VII, VIII). Asimismo, en 50 por ciento de las muestras con MNC fueron detectadas infecciones múltiples, a diferencia de las muestras de MGC en donde no se detectó infecciones múltiples. Conclusión: Existe una diversidad genética en esta región del gen GLURP de P. falciparum, para esa época (marzo 1998 - abril 1999) y esa área del país. En tal sentido, nuestros resultados podrían servir de base para llevar a cabo estudios epidemiológicos posteriores, ya que permitiría conocer la distribución de las cepas circulantes en nuestro país.